导 读

CRISPR/Cas9技术问世以来，迅速成为生物科学领域的游戏规则改变者，7月31日，第一个成功将CRISPR/Cas9搜索功能用于实践的生物技术初创公司-Mammoth Biosciences赢得了2300万美元融资，更是让CRISPR/Cas9技术进入烈火油烹的境界。然而，该技术导致双链DNA的断裂，一度成为阻碍CRISPR/Cas9技术发展的绊脚石。近日，著名学术期刊《Nature Genetics》发表的一篇文章表示科学家们发现了CRISPR/Cas9的第三条作用途径！而且这条途径中还存在可以修复断裂的DNA双链的关键蛋白！这对CRISPR/Cas9技术的进一步发展至关重要！

在谈新途径前，得先说说CRISPR/Cas9的“旧途径”是什么。简单点说，CRISPR/Cas9就是对DNA链进行切割和再修复，而所谓的“旧途径”就是指DNA再修复的两条常见途径。

在DNA链断裂后，CRISPR/Cas9有两个选择，要么直接添加碱基，破坏原有基因功能，通过沉默基因实现基因敲除，要么利用单链DNA模板，引入新的序列，对基因进行编辑。

这就是所谓的“非同源性末端接合（NHEJ）”与“同源介导修复（HDR）”。这两种途径存在很大的问题-一些DNA断裂后无法或难以及时修复，这也是日益喧嚣的“CRISPR/Cas9安全问题”的缘由之一。

那么，为什么NHEJ和HDR无法完全修复所有切割后的DNA链呢？这就要怪CRISPR/Cas9系统的“动态平衡”了。这就像一个可逆的化学方程，当基因编辑进行一段时间后，切割和修复过程就会自行达到平衡，这也是所谓的“饱和”问题。

而平衡后，尚有已断裂的DNA无人修复，从而导致一些基因功能的缺失。因此，要解决DNA断裂问题，就是要让这个平衡方程向修复方向最大程度倾斜，而加州大学伯克利分校的研究人员们发现的CRISPR/Cas9新途径-Fanconi贫血途径就有此功能。

FANCD2在Cas9切割的双链断裂位点富集

Fanconi贫血途径涉及21种不同的蛋白质，这些蛋白质的任何相关基因受损，都与一种罕见贫血症-Fanconi贫血症息息相关，这也是业内对该途径的普遍认识。然而，此次研究人员关注的是Fanconi贫血途径与CRISPR/Cas9的关系。

他们利用CRISPR干扰（CRISPRi）的技术对超过2000个基因进行切割，发现Fanconi贫血途径中的FANCD2蛋白可长期存在于CRISPR/Cas9产生的双链断裂位点上，调节FANCD2蛋白可以提高HDR频率。

也就是说，FANCD2蛋白可以打破CRISPR/Cas9系统存在的切割-修复平衡，使平衡向修复方向倾斜，提高基因编辑效率，降低不良反应。

Fanconi贫血途径基因敲除影响HDR效率

Fanconi贫血途径基因敲除不影响NHEJ效率

研究人员发现，Fanconi贫血途径并不作用于NHEJ，而是通过提高HDR效率将修复转向单链模板修复。Fanconi贫血途径与NHEJ是竞争关系，只要Fanconi贫血途径过度活跃，就会影响基因敲除的效率。另一方面，研究人员指出，FANCD2蛋白对HDR效率的影响力度超乎想象。

Fanconi贫血途径在体内普遍存在，一旦Fanconi贫血途径不够活跃，FANCD2蛋白功能受限，HDR就处于报废状态！也就是说，无法引入新的序列，无法基因进行编辑，CRISPR/Cas9系统只能崩溃！所以，如何把控Fanconi贫血途径的活性，是CRISPR/Cas9技术发展的重要课题！

Fanconi贫血途径活性影响基因敲除和基因编辑

而且，在CRISPR/Cas9系统里，FANCD2蛋白能且只能在Cas9切开的位点积聚，那么它就可以作为Cas9切口的有效标志，这就可以帮助科学家们快速准确地找出靶向和脱靶的切口。

研究人员指出，这项研究有助于加深我们对CRISPR/Cas9机制的进一步理解，有望提高基因编辑的效率，从而开发出更多有效的疗法，为更多疾病带来希望。

参考文献：

CRISPR-Cas9 genome editing in human cells occurs via the Fanconi anemia pathway

DNA Crosslink Repair Central to CRISPR Insert Success